為篩選綿羊肺炎支原體(MO)免疫相關蛋白,以MO新疆流行株基因組DNA為模板,通過PCR擴增其EF-P基因,測序后對其編碼蛋白進行分子特征分析;用生物信息學軟件預測其抗原表位集中區編碼片段;進一步將該基因片段克隆入pET-32a(+)中,構建原核表達載體pET-32a(+)-EF-P,將pET-32a(+)-EF-P質粒轉化至感受態細胞Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG誘導目的蛋白表達后,檢測重組蛋白反應原性和免疫原性。SDS-PAGE結果顯示,EF-P重組蛋白分子質量為29.5ku;Western blot結果顯示,該重組蛋白可被MO陽性血清特異性識別,證實其具有良好的反應原性;小鼠免疫試驗結果顯示,該重組蛋白可誘導機體產生特異性抗體,采用正向間接血凝方法檢測效價可達1∶64,提示其具有較強的免疫原性。

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【部分圖文】：

圖１ＭＯＥＦ－Ｐ基因的ＰＣＲ擴增Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；１～４．菌液ＰＣＲ產物ＰＣＲｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｑｕｉｄ

４個Ｎ－酰基化位點，在５１～６６位氨基酸處有１個ＧＴＰ結合延伸因子標簽（圖２）。利用在線軟件ＢｅｐｉＰｒｅｄ１．０ｂＳｅｒｖｅｒ預測發現，在１０９～２０５位氨基酸處有４個優勢抗原表位；經ＤＮＡＭＡＮ分析發現在該區域內不存在終止密碼子，可正常翻譯；ＭｏｔｉｆＳｃａｎ在線軟件分析發現....

圖３ＰＳＩＰＲＥＤ軟件預測的ＥＦ－Ｐ二級與三級結構Ｆｉｇ．３Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｄｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ

雙酶切后得到目的片段和ｐＥＴ－３２ａ（＋）載體片段（圖６），表明成功構建重組表達質粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）－ＥＦ－Ｐ。２．５表達產物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析顯示，ＩＰＴＧ誘導的樣品在２９．５ｋｕ處有明顯條帶，且與理論分析值相符，重組菌在ＩＰ....

圖４ＥＦ－Ｐ基因系統進化關系Ｆｉｇ．４ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐｅｃｉｅｓｂａｓｅｄｏｎＥＦ－Ｐｇｅｎｅ

分析ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析顯示，ＩＰＴＧ誘導的樣品在２９．５ｋｕ處有明顯條帶，且與理論分析值相符，重組菌在ＩＰＴＧ誘導８ｈ時表達量達到最高。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析結果表明，重組蛋白可被ＭＯ陽性血清識別，說明重組蛋白ＥＦ－Ｐ具有較好的反應原性（圖７）。圖３ＰＳＩＰＲＥＤ軟件預測的....

圖５ＥＦ－Ｐ的ＰＣＲ鑒定Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；１～３．菌液ＰＣＲ產物ＰＣＲｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｌｉｑｕｉｄ

（圖７）。圖３ＰＳＩＰＲＥＤ軟件預測的ＥＦ－Ｐ二級與三級結構Ｆｉｇ．３ＰｒｅｄｉｃｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｄｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＥＦ－ＰｂｙｕｓｉｎｇＰＳＩＰＲＥＤｓｏｆｔｗａｒｅ圖４ＥＦ－Ｐ基因系統進化關系Ｆｉｇ．４ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＭｙ....

本文編號：4002352