【目的】分析轉BtCry1Ac歐洲黑楊外源基因插入位點,從而進一步完善抗蟲轉基因楊樹的背景信息,推進抗蟲轉基因楊樹的安全評價及應用。【方法】以轉BtCry1Ac歐洲黑楊株系n12、n222為試驗材料,使用高效熱不對稱交錯PCR法(hiTAIL-PCR)分離外源基因插入位點側翼序列,比對毛果楊基因組序列確定插入位點。根據插入位點處的側翼序列設計2對特異性PCR檢測引物,建立轉BtCry1Ac歐洲黑楊外源基因特異性PCR檢測方法,并利用實時熒光定量PCR技術分析插入位點周邊基因表達情況。【結果】PCR及半定量PCR結果表明,轉基因歐洲黑楊株系的BtCry1Ac基因穩定表達。通過比對毛果楊基因組序列確定轉基因楊n12 T-DNA插入基因組Chr15的10162773位點即Potri.015G076600第2個內含子,其堿基組成AT含量為65%; n222整合位點為基因組Chr01基因間隔區41596184位點,其堿基組成AT含量為69%。特異性PCR檢測顯示,n12能擴增出709 bp(轉基因)和1 159 bp(非轉基因)特異性條帶,n222及其與丹紅楊雜交子代能擴增出1 265 bp(轉...

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圖1PCR檢測轉基因植株及轉基因表達量

將轉BtCry1Ac歐洲黑楊株系n12右邊界hiTAIL-PCR的第2輪和第3輪擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，以AC1、RB-1A為引物的第2輪和AC1、RB-2A為引物的第3輪擴增結果如圖2A所示。隨機引物LAD3第3輪產物應比第2輪小80bp(圖2A)。將隨機引....

圖2轉BtCry1Ac歐洲黑楊n12右邊界序列

圖1PCR檢測轉基因植株及轉基因表達量2.3轉BtCry1Ac歐洲黑楊n222及其雜交子代的T-DNA插入位點

圖3轉BtCry1Ac歐洲黑楊n222左邊界序列

轉BtCry1Ac歐洲黑楊株系n222的4條隨機引物第2輪和第3輪產物電泳，發現簡并引物LAD4的第2、3輪產物相差89bp(圖3A)，將條帶回收連接T載體，并測序獲得215bpDNA片段，1-122bp為載體序列，123-215bp與毛果楊數據庫比對發現與1號染色體4....

圖4轉BtCry1Ac歐洲黑楊n12(上)、n222(下)插入位點序列特異性檢測引物位置

株系n12插入Potri.015G076600第2個內含子，編碼絲氨酸蛋白激酶(serine-proteinkinase,SPK);下游2.7kb處為Potri.015G076700共濟失調毛細血管擴張癥突變家族蛋白(ataxiatelangiectasiamutated....

本文編號：4002913