研究目的： (1)觀察血必凈注射液對內毒素(Lipopolysaccharide, LPS)刺激下巨噬細胞增殖及吞噬功能的影響。 (2)觀察血必凈注射液對膿毒癥巨噬細胞分化的影響,并探索其發揮作用可能的信號通路。 研究方法： (1)分離提純小鼠腹腔巨噬細胞后,以1×106/ml密度種板。生長2h后,加入血必凈注射液(Omg/ml,1mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,50mg/ml,100mg/ml)孵育1h,再加入LPS (100ng/ml)刺激： 分別于12h,24h,48h加入細胞增殖-毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)試劑,孵育2h后,酶標儀檢測450nnm處的吸光值(OD450nm); 孵育24h后,更換混有熒光微球的培養基(1：100),培養2h后,磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution, PBS)清洗未被吞噬的熒光微球,免疫熒光顯微鏡觀察照相或用胰酶消化后上流式直接檢測。 (2)分離提純小鼠腹腔巨噬細胞后,以1×106/ml密度種板,生長2h后,加入血必凈注射液(Omg/ml,1mg/ml，5mg/ml,10mg/ml,50mg/ml,100mg/ml)孵育1h,再加入LPS (100ng/ml)刺激： 分別在6h,12h,24h收集上清,酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)-α,白介素(Interleukin, IL)-6, IL-10;收集細胞進行流式檢測F4/80+CD11c+CD206-及F4/80+CD11c-CD206+細胞比例； 分別在0h,0.5h,2h,6h,24h固定細胞,使用活細胞ELISA方法檢測Janus激酶(Janus Kinase)1-信號傳導及轉錄激活因子(Signal Transducers and Activators of Transcription, STAT)6總量及其磷酸化的比例。 (3)分離提純小鼠腹腔巨噬細胞后,以1×106/ml密度種板,分別給予JAK1及STAT6抑制劑干預2h后,再加入血必凈注射液(5mg/ml)培養1h,而后給予LPS (100ng/ml)刺激,24h后收集上清ELISA法檢測TNF-α,IL-6, IL-10;收集細胞流式檢測F4/80+CD100c+CD206-及F4/80+CD100c-CD206+細胞比例。 (4)制備小鼠盲腸結扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture, CLP)模型,實驗組給予血必凈注射液,對照組給予PBS,分別于術后0.5h,12h,24h,36h,48h,60h,72h,84h,96h進行肌肉注射： 術后12h,24h,48h,60h,72h,84h,96h,120h計數存活小鼠,Kaplan-Merer法進行生存率分析； 術后6h,24h,48h處死小鼠留取外周血血清檢測]TNF-α, IL-6,IL-10;灌洗腹腔巨噬細胞流式檢測F4/80+CD11c+CD206-及F4/80+CD11c-CD206+細胞比例。 結果： (1)在一定劑量(5mg/ml)的血必凈注射液干預下,LPS刺激下巨噬細胞增殖明顯,而高于10mg/ml的劑量則會產生明顯的抑制作用,在時間上則以48h時間點最為顯著；在5mg/ml及10mg/ml劑量的血必凈注射液干預下,LPS刺激后巨噬細胞的吞噬功能增強,而在50mg/ml和100mg/ml劑量下則產生抑制作用。 (2)在中等劑量(5mg/ml)的血必凈注射液干預下,LPS刺激后小鼠腹腔巨噬細胞由M1型向M2型分化,且以刺激24h最為明顯；當劑量高于10mg/ml時,這種促進作用減弱。 (3)中等劑量(5mg/ml)的血必凈注射液在2h時間點下,JAK1-STAT6磷酸化增強；給予JAK1以及STAT6特異性抑制劑后,促M2型分化的效應減弱。 (4)血必凈注射液干預組小鼠外周血血清M1型相關細胞因子(TNF-α、 IL-6)較對照組明顯降低,而M2相關的細胞因子(IL-10)較對照組升高；灌洗小鼠腹腔巨噬細胞中M2型巨噬細胞比例增加；小鼠生存率提高。 結論： (1)中等劑量(5mg/ml)的血必凈注射液可以促進LPS刺激下小鼠腹腔巨噬細胞的增殖,并增強其吞噬功能；而在高于10mg/ml的劑量下則會產生抑制作用。 (2)中等劑量(5mg/ml)的血必凈注射液可以促進LPS刺激下小鼠腹腔巨噬細胞由M1向M2分化,而在高于10mg/ml劑量下這種促進作用減弱；其作用的分子機制與JAK1-STAT6通路有關。 (3)血必凈注射液可以提高膿毒癥小鼠的生存率,且與其促進小鼠巨噬細胞的分化有關。
【學位單位】：天津醫科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R459.7
【部分圖文】：

10 50 100 mg/mi圖1-1流式細胞術檢測不同劑量下血必凈注射液對小鼠腹腔巨嗟細胞吞噴功能的影響XBJ Omg/ml XBJ 1mg/m丨 XBJ 5mg/ml盡盡盡■ ■■XBJ 10mg/ml XBJ 50mg/m丨 XBJ 100mg/ml圖1-2免疫焚光顯微鏡觀察不同劑量下血必凈注射液對小鼠腹腔巨隨細胞吞嗟功能的影響1.3討論當機體遭受外界病原入侵時，組織原位巨唾細胞（local macrophages)首當其沖，它通過識別、吞唾、抗原提呈等作用殺滅病原菌，釋放趨化因子（CXCL9、7
【參考文獻】

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1 姚詠明,盛志勇;膿毒癥信號轉導機制的現代認識[J];中國危重病急救醫學;2003年01期

本文編號：2839140