背景和目的蛛網膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)是臨床最常見的腦血管危急重癥之一,主要為顱內動脈瘤破裂所致。隨著神經影像和顯微手術的進步,動脈瘤破裂出血造成的直接死亡率明顯下降,但患者預后不佳,接近50%的幸存者伴有肢體癱瘓、情感或記憶障礙、喪失重新工作和生活自理能力。因此,針對SAH后繼發腦損傷的防治變得愈發重要,成為降低致死致殘率和改善患者預后的重要因素和研究熱點。SAH后繼發性腦損傷的機制至今尚未完全闡述清楚。既往研究均著眼于SAH后大血管痙攣上,認為顱內大動脈痙攣是SAH后最嚴重的并發癥。該認識來源于SAH患者的腦血管造影顯示其存在顱內大動脈(大于200μm)的縮窄,而SAH患者又會同時出現無法解釋的缺血性神經損傷樣癥狀。因此,血管一直以來被認為是引起SAH患者死亡或致殘的主要原因。然而,近年來其與SAH后繼發性神經功能障礙的關系備受質疑。一項應用選擇性內皮素A受體拮抗劑Clazosentan來治療SAH患者的多中心、隨機、安慰劑對照、雙盲的臨床研究結果顯示:Clazosentan能夠顯著逆轉腦血管造影所示的血管痙攣,但并不能改善SAH患者的神經功能預后。事實上,在顱內動脈瘤破裂引起SAH的同時,繼發性腦損傷就已經開始發生了。動脈瘤破裂的瞬間,顱內壓極速升高,甚至達到與動脈收縮壓相同的程度。因此,SAH患者最常見的主訴是“一生中從未有過的劇烈頭痛”。動物實驗證實,SAH后10分鐘內,興奮性氨基酸釋放、神經元凋亡、細胞壞死等病理生理過程已被激活。基于上述臨床和實驗研究結果,美國John H.Zhang教授將發生在SAH后最初72小時內的腦損傷定義為早期腦損傷(Early Brain Injury,EBI),認為早期腦損傷是影響SAH患者急性期死亡和幸存者后期神經功能缺損的重要因素,也是影響遲發性血管痙攣的重要因素,對早期腦損傷進行干預可明顯提高患者生存率和預后。然而,近年來單純針對神經元進行保護的臨床試驗均告失敗,促使大家在繼續研究SAH后神經元損傷的同時,愈加重視顱內各種細胞之間的廣泛聯系——血管神經網絡(vascularneuralnetwork)。該結構包括:內皮細胞、星形膠質細胞、周細胞、神經元以及與之直接相關的毛細血管、血管平滑肌細胞、血管內皮與管周神經纖維聯系、顱內微循環及其上下游小動靜脈。由于該結構中各種細胞之間存在簡單、快速的交流影響機制,所以保護該網絡中的其他結構與保護神經元同樣重要。血腦屏障(bloodbrainbarrier,bbb)是該網絡中最具代表性的神經血管單元(neurovascularunit),主要由內皮細胞及其緊密連接、星形膠質細胞、血管周圍的小膠質細胞、基膜、以及周細胞等組成,最終構成一個調節中樞神經系統內環境穩態的細胞屏障,維持腦組織內離子、激素和遞質的動態平衡,保護中樞神經系統不受損傷。臨床上,sah早期即可產生廣泛的全腦水腫,與血腦屏障損傷導致的血管源性水腫密切相關,是導致sah患者早期腦損傷和不良預后的主要因素之一。既往研究證實,血管神經網絡中毋庸置疑的存在著血腦屏障自我修復機制;因此,針對sah早期血腦屏障損傷的修復,可能成為未來sah等多種急性神經損傷疾病的可靠治療靶點。因此,本研究擬在前期工作基礎上,針對sah后血管神經網絡的關鍵靶點:神經元和血腦屏障,分別進行干預,探討sah后早期腦損傷的內在病理生理機制,為臨床轉化奠定基礎。此外,本研究擬進一步探索顱內微循環下游靜脈系統在sah后早期腦損傷發生發展中的作用,豐富早期腦損傷理論,為臨床sah患者救治提供可靠的新思路。材料與方法1、采用大腦中動脈線穿法建立大鼠蛛網膜下腔出血模型。2、采用bpv(pic)(0.2mg/kg)對sah模型大鼠進行干預,進而評價其神經功能障礙、腦含水量、伊文氏藍滲出量、海馬神經元死亡情況、以及谷氨酸ampa受體亞基變化。3、在sah術前48小時側腦室注射frizzled4sirna,sah術后3小時側腦室注射重組norrin蛋白,進而評價sah出血量、神經功能障礙、腦含水量、伊文氏藍滲出量,并用westernblot和免疫熒光染色檢測norrin及其受體、以及調節蛋白tspan12在調控血腦屏障連接蛋白中的分子作用機制。4、利用腦組織體積、腦組織內血液含量等指標評價sah后大腦血液循環淤積情況,并在sah模型的基礎上,觀察皮層引流靜脈和頸內靜脈回流障礙對sah后腦組織的影響。結果1、在sah后,作為pten活性標志的pten-ser380去磷酸化水平,能夠被bpv(pic)療法顯著抑制;同時,pten蛋白表達水平較sah+vehicle組亦顯著下降。我們同時發現bpv(pic)療法能夠顯著改善神經功能預后,對sah后早期腦損傷的各種急性病例改變起保護作用,包括血腦屏障破壞、腦水腫、神經元死亡等。這些神經保護作用于谷氨酸ampa受體亞基調控相關。具體來說,bpv(pic)治療后細胞膜上谷氨酸glur1亞基蛋白表達下降,谷氨酸glur2亞基和谷氨酸glur3亞基蛋白表達水平升高。這些結果顯示:bpv(pic)通過抑制pten對sah后早期腦損傷起到了保護作用。2、sah后內源性norrin蛋白在腦組織中顯著增高,波峰分別在sah后12小時及72小時。同時,norrin蛋白發揮作用的一個支持蛋白tspan12也在sah后顯著增高,并持續到sah后72小時。重組norrin蛋白能夠顯著改善sah后神經功能缺損和血腦屏障的破壞,這些神經保護作用與其促進β-catenin從細胞質轉移進入細胞核,以及上調occludin,ve-cadherin和zo-1蛋白表達水平有關。進一步研究發現,用小干擾rna抑制其受體frizzled4受體可以逆轉重組norrin蛋白療法的這些保護作用;表現為阻礙β-catenin向細胞核轉位并降低occludin,ve-cadherin和zo-1蛋白表達水平。綜合分析后我們認為norrin對于sah后血腦屏障損傷起到了保護作用。3、在sah后24小時,血管破裂同側大腦半球(左側半球)較右側大腦半球顯著腫脹,且左側大腦半球內血液含量較假手術組顯著升高,而右側大腦半球與假手術組沒有統計學差異。進一步分析顯示:左側大腦半球含血量與腫脹比例呈正相關關系,與大鼠改良garcia神經功能評分呈負相關關系,但與sah出血量評分無直接相關關系。皮層引流靜脈阻斷后,sah模型大鼠對應引流皮層局部發生明顯充血腫脹,而頸內靜脈結扎后可見靜脈引流區域微小靜脈較sah組顯著怒張。結論1、bpv(pic)療法能夠減輕sah后早期腦損傷程度,該作用是通過抑制pten進而調控谷氨酸ampa亞基所發揮的。基于bpv(pic)療法在低濃度下具有高選擇性和高效性,能夠顯著避免毒副作用,它可能會成為治療sah患者早期腦損傷的一個可靠治療方法。2、sah后腦組織中內源性norrin蛋白顯著增高;外源性重組norrin療法能夠保護血腦屏障完整性并改善神經功能預后,其機制可能與frizzled4受體介導的β-catenin核轉位并進一步增強內皮細胞間隙蛋白表達有關。因此,重組Norrin療法有可能成為改善SAH患者血腦屏障功能的可靠的新選擇。3、SAH后腦組織存在循環血流量淤積,損傷同側大腦半球更為顯著;頸部大靜脈和皮層引流小靜脈回流障礙會加重SAH后腦組織腫脹,進而加重早期腦損傷和神經功能預后。因此,恢復SAH后動靜脈系統平衡,對于緩解早期腦損傷至關重要。4、血管神經網絡對于維持腦組織穩態起到了關鍵的作用,SAH后針對血管神經網絡的病理生理改變進行針對性保護,可以顯著減輕早期腦損傷,并最終改善患者預后。基于血管神經網絡進行臨床轉化醫學研究可能對于SAH患者的臨床救治提供可靠的新治療方案。
【學位單位】：第三軍醫大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R651.15
【文章目錄】：
縮略語表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
第二章 抑癌基因PTEN在SAH后神經元損傷中的作用及機制
    2.1 研究背景
    2.2 材料與方法
    2.3 結果
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 Norrin蛋白在SAH后血腦屏障損傷修復中的作用及機制
    3.1 研究背景
    3.2 材料與方法
    3.3 結果
    3.4 討論
    3.5 小結
第四章 顱內靜脈系統在SAH后早期腦損傷發生發展中的作用
    4.1 研究背景
    4.2 材料與方法
    4.3 結果
    4.4 討論
    4.5 小結
全文總結
參考文獻
文獻綜述一 靜脈系統在急性腦損傷中的作用及病理生理機制
    參考文獻
文獻綜述二 周細胞在蛛網膜下腔出血后早期腦損傷中的作用
    參考文獻
攻讀學位期間的研究成果
致謝

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本文編號：2839311