目的目前迫切需要尋找確定治療骨肉瘤的新分子靶標。環狀RNA是一類內源性RNA,廣泛存在于哺乳動物細胞中,并在調節基因表達中發揮關鍵作用,但在骨肉瘤中,環狀RNA的潛在分子機制仍知之甚少。在這里,我們評估了骨肉瘤中環狀RNA circFAT1的在骨肉瘤發生發展中的功能及特性。方法首先體外實驗明確circFAT1在骨肉瘤中環狀RNA的特性,評估circFAT1/miR-375/YAP1對人骨肉瘤細胞生長,凋亡,遷移,侵襲和腫瘤發生的影響。通過蛋白質印跡,熒光定量鏈式擴增反應,熒光原位雜交,顯色原位雜交,RNA結合蛋白免疫沉淀和免疫熒光分析相關信號通路以及circFAT1與miR-375結合模式、功能及具體結合位點。在攜帶143B骨肉瘤細胞異種移植物的腫瘤生長小鼠中評估了circFAT1及miR-375在骨肉瘤發生發展過程中的功能及作用,以及兩者之間具體的結合模式。結果在這項研究中,我們觀察到人骨肉瘤組織和細胞系中FAT1基因外顯子2產生的circFAT1明顯上調。降低骨肉瘤細胞中circFAT1有效地阻止了骨肉瘤細胞的遷移,侵襲和腫瘤發生,并在體內抑制了骨肉瘤的生長。我們觀察到人骨肉瘤組織和...

【文章頁數】：125 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖1.1 circFAT1在骨肉瘤組織及細胞中表達顯著增高

為了研究circFAT1在骨肉瘤發育中的功能,我們檢測了circFAT1在12對軟骨瘤和骨肉瘤組織以及骨肉瘤細胞系中的表達水平。通過使用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT–PCR)和顯色原位雜交(CISH),我們發現circFAT1在OS組織和細胞系中上調(圖1.1)。3.2circFA....

圖1.2 circFAT1在骨肉瘤細胞系中的特征

然后,我們通過Sanger測序證實了circFAT1RT-PCR產物從頭到尾的剪接以及cir-cFAT1的大小(圖1.2d)。但是,可以通過轉拼或基因組重排產生頭尾拼接。因此,我們排除了這些可能性。首先,我們設計了收斂引物來擴增FAT1mRNA,并設計了不同引物來擴增cir....

圖1.3 circFAT1在骨肉瘤細胞系中的功能

為了探索circFAT1在OS細胞中的功能,我們將circFAT1小發夾RNA(shRNA)構建體轉染到143B和HOS細胞中。該轉染靶向circFAT1的連接位點,并建立了穩定的敲低細胞。在這些細胞中,circFAT1的表達顯著降低(圖1.3a)。相反,FAT1mRNA的表達....

圖2.1 CircFAT1充當骨肉瘤細胞中miR-375的海綿。

由于circFAT1在細胞質中豐富且穩定,因此我們對在線AGO2免疫沉淀數據進行了分析,其中包括來自doRiNA的高通量測序。結果表明,在circFAT1區域中AGO2的占有率很高,在整個脊椎動物物種中高度保守(圖2.1a)。為了驗證這一結果,我們對HOS細胞中AGO2進行了RN....

本文編號：4059193